УДК: 576.316+612.64.6+612.613.1

А.В. Светлаков, В.Г Артюхова, Е.В. Маркова

 

ЗАДАЧИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

Центр репродуктивной медицины, г. Красноярск.

Введение.

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) является новым направлением генетического тестирования и вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Такая диагностика дает возможность проводить исследование хромосомных нарушений и моногенных дефектов в эмбрионах человека и предоставляет чрезвычайно эффективный подход для профилактики наследственной патологии.

 

 

Предложенная в 1990 г. как исследовательская процедура, ПГД сегодня все шире используется в клинической практике ВРТ. По данным ESHRE PGD Соnsortium — международной организации, проводящей анализ циклов ПГД в мире, - на сегодняшний день проведено 12397 циклов ПГД и рождено 1988 детей [1].

В настоящее время развивается два основных направления ПГД: ПГД хромосомных нарушений (скрининг анеуплоидий) и ПГД в случае высокого генетического риска (генных дефектов и хромосомных перестроек) [2]. Эти разновидности ПГД отличаются по показаниям для проведения и методами анализа.

В задачи ПГД входит, прежде всего, снижение генетического риска в отношении хромосомных и генных болезней. Кроме того, обсуждается вопрос о повышении результативности программ ВРТ в случае скрининга анеуплоидий. Дискуссионным остается вопрос преимплантационной селекции по полу без медицинских показаний. В качестве эффективного метода селекции лучших эмбрионов, ПГД может служить критерием для переноса меньшего числя эмбрионов и, как результат, снижения частоты многоплодной беременности.

Во всех случаях ПГД рекомендовано генетическое консультирование на этапах до проведения ПГД и перед переносом эмбрионов. Пациенты должны получить полную информацию об объеме и алгоритме планируемых генетических исследований и возможных генетических статусах эмбрионов [2].

Опыт Красноярского Центра репродуктивной медицины (КЦРМ) основан на проведении ПГД анеуплоидий с 2004 г. с применением метода FISН-анализа (флуоресцентной гибридизации in situ) полярных телец и бластомеров.

Эмбриологический этап ПГД.

Проведение экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) дает возможность изучения самых ранних стадий развития человека - от оплодотворения до имплантации в матке. Все эти этапы, в отличие от обычного зачатия, происходят вне организма, т.е. in vitro. Поэтому имеется возможность выполнить дополнительные исследования эмбрионов для отбора по определенным характеристикам. В обычной практике ЭКО принята тактика выбора лучших эмбрионов для переноса в матку по морфологическим признакам [3]. На сегодняшний день можно проводить селекцию эмбрионов и по генетическим характеристикам.

Для генетического тестирования эмбриона необходима процедура биопсии - забора одной клетки эмбриона. ДНК единичной клетки достаточно, чтобы выявить генетические нарушения. Для ПГД используются клетки эмбриона (6-8 клеточной стадии) и полярные тельца (PBs, polar bodies). Генетическое тестирование полярных телец в ПГД разработано и успешно используется группой Ю. Верлинского [4]. В настоящее время некоторые репродуктивные центры в мире основываются на анализе только бластомеров, другие - на анализе PBs и бластомеров. Сочетание генетического тестирования бластомеров и полярных телец повышает эффективность и расширяет возможности ПГД. На рис.1. представлен алгоритм эмбриологических микроманипуляций, которые проводятся в ходе ПГД в КЦРМ.

Биопсия полярных телец производится либо последовательно (первое – до проведения оплодотворения, второе – после), либо одновременно. Для хромосомного анализа методом FISH достаточно одновременной биопсии, для молекулярно-генетического исследования с использованием ПЦР обязательно необходима последовательная биопсия полярных телец. Необходимо также отметить, что для проведения ПГД с применением ПЦР в качестве метода ВРТ используется только ИКСИ (инъекция сперматозоида в яйцеклетку), поскольку это предотвращает контаминацию ДНК сперматозоидов. Полярные тельца фиксируются на предметном стекле (для FISН-анализа) или помещаются в микропробирки (для ПЦР-анализа). Полярные тельца служат побочным продуктом мейотического деления и не требуются для дальнейшего развития эмбриона.

Анализ полярных телец используется для изучения генетических нарушений материнского происхождения. Эмбрион после биопсии полярных телец подвергается стандартному культивированию, и на этапе дробления на стадии 6-8 клеток проводится биопсия бластомера. Забирается один бластомер от каждого эмбриона и, также как и полярные тельца, фиксируется на предметном стекле (для FISH) или помещается в микропробирку (для ПЦР).

Большое число исследований свидетельствует о том, что проведение такой инвазивной для эмбриона микроманипуляции как биопсия не оказывает негативного воздействия на его дальнейшее развитие. Тем не менее, биопсия полярных телец считается намного более безопасной [5]. Реже используется биопсия двух бластомеров одного эмбриона. 
При использовании ВРТ перенос эмбрионов возможен на 3-6 сутки. Пролонгированное культивирование расширяет возможности для выбора лучших эмбрионов по морфологическим характеристикам и абсолютно необходимо при проведении ПГД, т.к. это время будет затрачено на проведение генетического анализа.

Преимплантационный скрининг анеуплоидий.

Преимплантационный скрининг анеуплоидий (PGS) получил в настоящее время более широкое развитие в сравнении с ПГД генных дефектов [6]. Это связано как с более широкими показаниями для его проведения, так и с более универсальными технологиями генетического анализа. Показания к преимплантационному скринингу анеуплоидий непосредственно охватывают достаточно большую часть пациентов репродуктивного центра.
Показания к проведению ПГД, используемые в КЦРМ, основаны на международных рекомендациях [7-8] и собственном опыте работы:

1. возраст пациентки, планирующей беременность, более 35 лет;
2. более трех безуспешных попыток ЭКО/ИКСИ в анамнезе;
3. невынашивание беременности на ранних сроках;
4. мужской фактор бесплодия (использование единичных тестикулярных или эякуляторных сперматозоидов при азооспермии или олигозооспермии);
5. семейные случаи сцепленных с полом наследственных заболеваний;
6. наличие структурных перестроек в кариотипе пациентов.

В ряде случаев ПГД проводится по желанию пациентов. Пациенты, имеющие одно из трех первых показаний для ПГД, составляют так называемую «группу с плохим прогнозом».

Для хромосомного анализа в ПГД используется метод FISH. Предложены и в ряде случае используются и другие методы преимплантационного скрининга анеуплоидий. В клинической практике ПГД вместо FISH может быть использован метод ПЦР. Согласно рекомендациям ESHRE для ПГД при скрининге анеуплоидий рекомендован именно метод FISH [7].

Спектр исследуемых в ПГД хромосом определяется частотой их вовлеченности в анеуплоидию у человека [2]. Разными лабораториями при проведении ПГД анализируется от 3 (21, Х, У) до девяти хромосом. Исследование девяти хромосом фактически исчерпывает возможности FISH на одной клетке.

При проведении ПГД на базе КЦРМ анализируется семь хромосом: 13, 16, 18,21,22, Х и У, что отвечает наиболее общим современным стандартам PGS [2]. Мультицветная FISH проводится для полярных телец•и бластомеров с набором зондов «MultiVysion РВ» (Abbott Molecular Inc., USA), включающий LSJ 13 - SpectrumRed, СЕР 16 - SpectrumAqua, СЕР 18 - SpectrumВlue, СЕР LSI 21 - SpectrumGreen, LSI 22 - SpectrumGold и зонды на половые хромосомы СЕР Х SpectrumGreen СЕР У - SpectrumOrange.

На рис. 2. представлена схема F1SН-анализа, используемая при проведении ПГД в КЦРМ. Анализ результатов гибридизации проводится на флуоресцентном микроскопе. Важное значение имеет применение критериев подсчета гибридизационных сигналов [9].

По результатам подсчета числа гибридизационных сигналов в полярных тельцах и бластомерах делается вывод о хромосомном составе в отношении исследованного набора хромосом. 
FISH полярных телец на хромосомы 13, 16, 18, 21, 22
FISH бластомеров на хромосомы 13, 16,18, 21, 22
FISH бластомеров на хромосомы Х и Y
Рис. 2. Схема FISН-анализа в ПГД.

Результаты накопленного в мире опыта PGS доказывают высокую частоту хромосомных нарушений в эмбрионах человека, которая варьирует в зависимости от показаний к ПГД. Согласно нашим результатам исследования более 900 эмбрионов, полученных в ходе 105 лечебных циклов, эуплоидные эмбрионы составили 48,9% [10]. Исследования особенностей морфологии эмбрионов в зависимости от их хромосомного состава не позволяют сделать заключение о наличии достоверных морфологических маркеров хромосомной патологии эмбрионов [11].

Преимплантационная генетическая диагностика для семей с высоким генетическим риском.

Особенностью ПГД в случае семей с высоким генетическим риском, Т.е. с хромосомными перестройками в кариотипе родителей или семейных случаев генных болезней, является необходимость подготовительного этапа. В ходе этого этапа подбирается схема генетического исследования, которая тестируется на клетках пациентов [7]. Алгоритм проведения разных типов ПГД в сочетании с генетическим консультированием представлен на рис. 3.

Рис. 3.Алгоритм проведения разных типов ПГД в сочетании с генетическим консультированием.
Генетическое консультирование имеет особое значение при проведении такой ПГД, поскольку пациенты должны быть информированы не только о генетическом риске, но и о значении подготовительного этапа и его результатов. На подготовительном этапе для конкретного семейного случая подбираются и заказываются зонды для анализа транслокации или праймеры для анализа генного дефекта. В отличие от скрининга анеуплоидий, в котором используется стандартизированный подход генетического анализа, при анализе транслокаций и моногенных дефектов применяется индивидуальный подход, ввиду многообразия возможных нарушений такого рода. Подобранные для данного семейного случая системы генетического тестирования проверяются на клетках родителей. После этого проводится консультирование относительно результатов подготовительного этапа и выбора тактики ПГД, которая может сочетать преимплантационный генетический анализ определенного дефекта со скринингом анеуплоидий.

Таким образом, ПГД в случае высокого риска хромосомных транслокаций генных дефектов представляет собой более сложную технологию в сравнению с ПГД анеуплоидий.

Преимплантационная генетическая диагностика моногенных дефектов.

ПГД моногенных дефектов актуальна для семей с высоким генетическим риском в отношении моногенной патологии. Если в соответствии с законами генетики и генотипами родителей очевидно, что проявление таких генов неизбежно в виде тяжелой болезни, то для переноса могут быть отобраны только генетически полноценные эмбрионы. ПГД генных дефектов позволяет избежать не только рождения больного ребенка, но даже избежать такой беременности, поскольку селекция по генотипу про водится еще на этапе до имплантации. В данном случае к ПГД прибегает совершенно иная, чем в случае PGS, категория пациенток. Для таких пациентов бесплодие в основном не характерно. ВРТ использует исключительно с целью проведения отбора эмбрионов по генетическим характеристикам.

Процедура ПГД моногенных дефектов в мире проводится рядом репродуктивных центров. Отработаны как эмбриологические, так и генетические этапы такой диагностики. К настоящему времени в мире проведено уже более 2 тыс. циклов ПГД для сотни генетических дефектов. Огромный опыт накоплен Институтом репродуктивной генетики человека в Чикаго (RGI, Reproductive Genetic Institute), который является пионером и мировым лидером развития технологии ПГД. На сайте RGI (www.reproductivegenetics.com) представлен перечень моногенных дефектов, для которых разработана и проведена схема ПГД, приведены данные о полученных беременностях и рожденных детях.

Теоретически ПГД может быть использована для абсолютно любого генного дефекта, для которого возможна молекулярно-генетическая диагностика. Однако, для про ведения ПГД необходимо, чтобы такая диагностика была проведена для семьи, и установлена мутация.

Кроме мутации в ПГД необходимо использовать анализ сцепленных маркеров для повышения точности анализа [7]. Для эффективного проведения преимплантационного анализа генного дефекта должна использоваться группа сцепления, включающая, помимо мутации, информативные маркеры. Этот весьма важный аспект ПГД связан с использованием малого количества генетического материала - всего по одной копии каждого аллельного гена. При этом высока вероятность явления выпадения «аллеля» - ADO (аllеlе drop out). Для гаплотипирования на подготовительном этапе могут быть использованы образцы ДНК родителей и детей пациентов, планирующих ПГД. У мужчины для этой цели могут применяться единичные сперматозоиды.
Если по итогам подготовительного этапа молекулярно-генетический анализ не подтвердил мутацию или не найдено информативных маркеров, то в таких исключительных случаях в проведении ПГД пациентам может быть отказано. Эта процедура сопряжена с большими временными и финансовыми затратами, и если молекулярная диагностика не позволяет выявлять дефект на подготовительном этапе, то его невозможно будет выявить и в самом цикле ПГД.

Основным методом ПГД моногенных дефектов в настоящее время является ПЦР, которая позволяет многократно умножить интересующие последовательности и сделать их доступными для анализа. Наиболее часто применяется двухэтапная ПЦР. В первом раунде мультиплексной ПЦР в пробирке с ДНК из единичной клетки амплифицируются все интересующие локусы. Во втором раунде проводятся индивидуальные ПЦР для каждого локуса. По результатам анализа делается заключение о генотипах эмбрионов.

Преимплантационная генетическая диагностика транслокаций.

Для пациентов, являющихся носителями структурных перестроек в кариотипе, особенно реципрокных и робертсоновских транслокаций, повышен генетический риск спонтанного прерывания беременности. Для ПГД в случае транслокаций может быть использовано несколько методических приемов. Обычная схема анализа состоит в применении сочетания центромероспецифических и субтеломерных зондов к перестроенным хромосомам. Такие зонды предварительно тестируются на клетках пациента. Ограничением данного метода служит то, что при его использовании на интерфазных ядрах невозможно по числу меток отличить кариотип со сбалансированной транслокацией от нормального. Однако несбалансированные варианты кариотипов хорошо идентифицируются по числу меток.

Предложены подходы ПГД транслокаций, при которых можно отличить транслокационный кариотип от нормального — техника конверсии единичных интерфазных клеток в метафазные [12]. Получение метафазных пластинок из единичных бластомеров позволяет применять полнохромосомное окрашивание (WCP) для идентификации хромосомных перестроек. Необходимо отметить, что пока такая техника далека от широкого применения. В большинстве случаев используется интерфазный FISН-анализ с зондами на хромосомы, вовлеченные в перестройку.

При проведении ПГД транслокций рекомендовано сочетание такого анализа со скринингом анеуплoидий, что связано с межхромосомным эффектом - повышением частоты нарушений сегрегации хромосом в мейозе у носителей хромосомных перестроек.

Перспективы преимплантационной генетической диагностики.

На сегодняшний день ПГД доказывает свою эффективность в профилактике генетических нарушений, поэтому важнейшей перспективой является ее более широкое внедрение в клиническую практику. Развитие ПГД раскрывает новые возможности для терапии наследственных заболеваний и научных исследований.

Актуальным направлением преимплантационного скрининга анеуплоидий служит разработка подходов преимплантационного анализа не ограниченного числа хромосом, а полного хромосомного набора, например, с использование метода сравнительной геномной гибридизации (CGH) [13].

В настоящее время предложено и уже успешно используется преимплантационное HLA -типирование в сочетании с анализом генных дефектов. К такой разновидности ПГД прибегают пациенты, для которых единственным выходе лечения тяжело больного ребенка является пересадка клеток пуповинной крови от НLА-совместимого сибса [14].

Из аномальных эмбрионов человека с генетическими дефектами, как гeнными, так и хромосомными, получены линии эмбриональных стволовых клеток [ 12]. Такие линии возможно использовать для исследования молекулярных механизмов патогенеза генетических нарушений.

Важно также отметить, что с помощью ПГД при обретаются новые знания генетике ранних этапов эмбрионального развития человека.

ЛИТЕРАТУРА

1. Harper J. PGD registries: ESHRE PGD Consortium / PGDIS: 8th Intemational Symposium of РGD // Reprod Biomed Online. 2008. V. 16. Suppl. 3. Р. 12-23.
2. Soini S., Ibаrretа D., Anastasiadou V et а1. The interface between assisted reproductive technologies and genetics: technical, social, ethical and legal issues // Eur. J. Нum. Genet. 2006. V. 14.588-645.
3. Human preimplantation embryo selection / Ed. bу Elder К. and Cohen J.- Informa healthcare, 2007.- 370 р.
4. Verlinsky У., Ku1iev А. Practical preimplantation genetic diagnosis.- Springer, 2005.- 198 р.
5. Gianaroli L. Preimplantation genetic diagnosis: polar body and embryo biopsy // Hum. Reprod. 2000. V.15. Suppl. 4. Р. б9-75.
6. Donoso Р., Staessen С., Fauser B.C.J.M., Devroey Р. Сurrent value of preimplantation gene aneulploidy screening in IVF // Hum. Reprod. Upd. 2007. У. 13. М2 1. Р. 15-25.
7. Тhornhill A.R., Die-Smulders с.Е., Geraedts J.P. et al. ESHRE PGD Consortium 'Best practi gllidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (FGD) and preimplantation gene screening (PGS)' // Hum. Reprod. 2005. V. 20. М2 1. Р. 35-48.
8. Gllidelines for good practice in PGD: programme requirements and laboratory quality assurance Reprod. Вiоmеd. Online. 2008. V. 16. М2 1. Р. 134-147.
9. Мunne S., Marques C., Magli С., et al. Scoring criteria for preimplantation genetic diagnosis numerical аbnormalitiеs for preimplantation genetic diagnosis of numerical аbnormalitiеs for chromosomes Х, У, 13, 16, 18,21 and 22// Mol. Hum. Reprod. 1998. V. 4. Р. 863-870.
10. Артюхова В.Г., Лебедев И.Н., Серебренникова О.А., Светлаков А.В. Структура численных хромосомных нарушений в преимплантационных эмбрионах человека // Генетика человека и патология. Выпуск 7. Томск: Печатная мануфактура. 2007. С. 215-219.
11. Kuliev А., Verlinsky У. Meiotic and mitоtiс nondisjunction: lesson from preimplantation gene diagnosis // Hum. Reprod. 2004. У. 10. М2 5. Р. 401-407.
12. Verlinsky У., Kuliev А. Atlas оf preimplantation genetic diagnosis.- Taylor and Francis, 2005.- 288
13. Лебедев ИЯ., Черемных А.Д., Назаренко С.А., Светлаков А.В. Полногеномная амплификация ДНК: современные достижения и перспективы использования в преимплантационной генетической диагностике // Проблемы репродукции. 2005. т. 2. М2 5. 60-67.
14. Rechitsky S. Preimplantation genetic diagnosis with HLA matching // Reprod. Biomed. Online 2004. V. 9. М2 2. Р. 210-221.